Планктонный штамм chlorella kessleri, предназначенный для получения биомассы

Владельцы патента RU 2613424:

Изобретение относится к биотехнологии. Планктонный штамм одноклеточной зеленой водоросли Chlorella kessleri NF обладает высокой продуктивностью. Штамм депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ Al-12 и может быть использован для получения биомассы, использующейся как корм для сельскохозяйственных животных, а также как альголизант водоемов при их биологической реабилитации и очистке сточных вод. 1 ил., 1 табл., 1 пр.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой новый штамм одноклеточной зеленой водоросли Chlorella kessleri NF, предназначенный для получения биомассы.

Известен штамм одноклеточной зеленой водоросли Chlorella vulgaris ИФР № C-111, предназначенный для получения биомассы, которая составляет 30 г/м 2 сухой биомассы в сутки, и отвечающий требованиям промышленного культивирования (патент RU 1751981).

Недостатками штамма Chlorella vulgaris ИФР № C-111 являются низкая биомасса получаемой продукции и длительный срок ее культивирования (четыре дня).

Известен штамм одноклеточной зеленой водоросли Chlorella vulgaris BIN, предназначенный для получения биомассы и очистки сточных вод, нетребовательный к питательной среде; при производственном культивировании за одни сутки сухая биомасса составляет 60-65 г/м 2 (патент RU 2192459).

Недостатками штамма Chlorella vulgaris BIN являются сравнительно низкая биомасса получаемой продукции и длительный срок ее культивирования (четыре дня).

Известен планктонный штамм одноклеточной зеленой водоросли Parachlorella nurekis 1904 KIEG, отличающийся высокой продуктивностью при производственном культивировании: 70 г/м 2 сухой биомассы за сутки (патент RU 2527895).

Недостатками планктонного штамма Parachlorella nurekis 1904 KIEG являются сравнительно низкая биомасса получаемой продукции и длительный срок ее культивирования (три дня).

Наиболее близким аналогом предлагаемого изобретения (прототип) является штамм микроводоросли Chlorella vulgaris 711-54, обладающий высокими показателями степени очистки сточных вод сельскохозяйственных и спиртовых производств, значительной продуктивностью и высоким содержанием ценных соединений в биомассе (патент RU 2555519). При выращивании на модельной среде (вытяжка из куриного помета), сточных водах птицефабрик и сточных водах спиртовых производств с использованием для культивирования фотобиореактора с постоянным освещением и барботированием среды атмосферным воздухом при температуре 25-27°C получена биомасса 160-180 г сухого веса/м 2 в сутки (1,6-1,8 г сухого веса/л в сутки). Недостатками прототипа являются накопление низкой биомассы культурой Chlorella vulgaris 711-54 (в 5,0-5,5 раз ниже предлагаемого изобретения), сложный состав питательной среды, а также необходимость барботирования культуры атмосферным воздухом.

Цель данного изобретения состоит в создании нового планктонного штамма микроводоросли для получения биомассы, использующейся как корм для сельскохозяйственных животных — основы увеличения привеса, продуктивности, эффективности рационов и повышения сохранности поголовья; как альголизант водоемов при их биологической реабилитации, а также при очистке сточных вод.

Техническим результатом настоящего изобретения является получение штамма микроводоросли, способного активно продуцировать биомассу на среде с включением в ее состав фугата послеспиртовой барды, использование которого предельно сокращает срок производства биомассы (см. таблицу 1).

Исходным для селекции Chlorella kessleri NF, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ А1-12, был штамм Chlorella vulgaris BIN из коллекции Пензенского научно-исследовательского института сельского хозяйства Россельхозакадемии, который культивировался на питательной среде с включением в ее состав фугата послеспиртовой барды.

В результате селекции был отобран штамм, отличающийся высокими показателями производства биомассы за предельно минимальный срок.

Взрослые клетки — шаровидные, диаметром 8-10 мкм, при образовании автоспор 11 мкм. Хлоропласт плотно прилегает к оболочке, по форме широкопоясковидный незамкнутый и выстилает 2/3 поверхности клетки. Пиреноид окружен крахмальной оберткой, состоящей из двух полусфер. В старых клетках хлоропласт чашевидный. Молодые клетки размером 1-3 мкм. Автоспор образуется 8-16 (редко 32), по форме тетраэдрические или эллипсоидные, после освобождения из материнской клетки часть из них свободные, другие соединены вместе в цепочку по 6-10 клеток, через некоторое время они рассыпаются на отдельные клетки. Число спор бывает только четное. На агаризированной минеральной среде на шестой день на свету образуются выпуклые гладкие блестящие колонии с ровными краями. Диаметр колоний 1-2 мм, окрашены в темно-зеленый цвет, размер клеток 7-8 мкм. Клетки, как молодые, так и взрослые, темно-зеленого цвета.

Штамм автотрофный, как в лабораторных, так и в производственных условиях растет на комплексной питательной среде, состоящей из растворов четырех составов химических реактивов на один литр водопроводной воды и фугата послеспиртовой барды, причем последний вводится в питательную среду до получения уровня pH не ниже 7,0.

Составы питательной среды (1):

состав №1: азотно-фосфорный — 0,30 мл;

состав №2: железисто-натриевый — 0,15 мл;

состав №3: медно-кобальтовый — 0,15 мл;

состав №4: сернокислого калия — 0,33 мл.

Штамм не требует подачи углекислого газа и барботирования культуры воздухом.

Введение фугата в суспензию хлореллы способствует образованию бактериально-альгологического микробиоценоза, что в значительной мере ускоряет протекание биологических процессов в высокопродуктивной экосистеме аквакультуры (см. чертеж) [Богданов Н.И., Эгамов М.С., 1993 (стр. 26)].

Штамм приспособлен к прямому солнечному освещению или освещению лампами, ДНаТ- или ДРИ-250. Суточный ритм освещения как при солнечном, так и при искусственном состоит из двух фаз — световой и темновой, при этом первая составляет 20 часов, вторая 4 часа. Однако световая, как и темновая, включает два равных периода по 10 и по 2 часа. Поле каждой световой фазы на 2 часа отключается освещение лампами для исполнения режима темновой фазы. Спорообразование и деление клеток наступает после каждой световой фазы. За период темновой фазы в культуру выходят автоспоры. При солнечном освещении или освещении лампами температура суспензии хлореллы не должна превышать 30°C. Оптимальная температура культуры во время световой фазы 28-30°C, в темновой фазе 23-25°C; культура выдерживает температуру до 33°C.

Цикл развития штамма за суточный период следующий: в световую фазу первого периода, который длится 10 часов, идет активный процесс фотосинтеза, в результате чего клетки интенсивно набирают биомассу. Размеры клеток увеличиваются до 8-10 мкм, клетки со спорами достигают 11 мкм. К концу первой фазы светового периода основная часть клеток со спорами или они уже поделились. В это время наступает первая фаза темнового периода, которая длится 2 часа. К концу первой фазы темнового периода в культуре преобладают молодые клетки. По окончании первой фазы темнового периода наступает вторая световая фаза, которая длится так же, как и первая — 10 часов. Активный процесс фотосинтеза продолжается, молодые клетки увеличиваются в размере до 8-10 мкм и соответственно набирают биомассу. В начале второго темнового периода биомасса становится максимальной, ее сливают и используют в виде суспензии или центрифугируют. Продуктивность штамма за сутки составляет 8-10 г/л сухого веса.

Таким образом, клеточное деление, формирование и освобождение автоспор происходит два раза в течение суток и имеет строгую привязку к определенному времени.

Штамм обладает планктонными свойствами, т.е. находится во взвешенном состоянии и свободно парит в водной толще, а также равномерно распределятся в культуральной среде благодаря тому, что клетки несут на себе отрицательный заряд.

Данная культура не реагирует на сезонность, отмечается высокая бактерицидность к патогенной микрофлоре (Протокол испытаний №16587, прилагается), агглютинация отсутствует, автолиз клеток не наблюдается.

Штамм строго соблюдает условия монокультуры по отношению к прочим водорослям и обладает невосприимчивостью к фагам.

Клетки в культуре чувствительны к динамическим ударам и погибают, например, при длительных перевозках в неприспособленных емкостях, а также при механическом перемешивании культуры в установках с электрическими насосами. При культивировании штамм требователен к строгому соблюдению биотехнологии выращивания, составу питательной среды и фугату послеспиртовой барды, при этом к использованию допускается зерновой (пшеница, кукуруза, ячмень) фугат.

Биотехнологические свойства и особенности культивирования

Для культивирования штамма используется «Установка для непрерывного выращивания планктонных водорослей» (патент RU 2571939), которая позволяет использовать как светильники, так и солнечное освещение. Установка содержит расположенные на каркасе два аквариума для суспензии, светильники, емкости для приготовления питательного раствора и для сбора и хранения готовой суспензии, соединенные с аквариумами трубопроводами. Аквариумы соединены между собой трубопроводом для уравновешивания объема в каждом аквариуме. Один из аквариумов для суспензии выполнен с возможностью выращивания маточной культуры и обеспечивает единый биотехнологический процесс. Светильники в каждом аквариуме расположены эксцентрично по отношению к его продольной оси. Оптимальные условия культивирования, которые создаются в установке, позволяют за один день получить нормативную оптическую плотность суспензии в пределах 1,8-2,0 D (440). Культивирование штамма ведется с соблюдением санитарии, однако создание условий стерильности не требуется.

Культивирование планктонного штамма Chlorella kessleri NF с использованием фугата послеспиртовой барды в составе питательной среды способствует интенсивному набору биомассы, во много раз превышающей известные штаммы (табл.), причем без подачи углекислого газа, барботирования воздухом, а также исключая постоянное перемешивание суспензии.

Пример получения биомассы

В аквариумы «Установки непрерывного выращивания планктонных водорослей» по патенту 2571939 вводят питательную среду (1) и маточную культуру планктонного штамма Chlorella kessleri NF с оптической плотностью 1,8-2,0 D (440) в соотношении 1:1. Включают освещение на 10 часов. В процессе культивирования температуру суспензии в аквариумах поддерживают на уровне 28-30°C. По истечении этого периода лампы отключают на 2 часа. По окончании 2 часов повторно включают лампы на 10 часов. По окончании второго светового периода культуру сливают и используют для выпаивания животным или центрифугируют для получения биомассы. За суточный период культивирования биомасса составляет 10 г/л сухого веса.

Смотрите так же:  Перерасчет по оплате услуг жкх

Следующие материалы иллюстрируют достижение цели. Получена биомасса с использованием планктонного штамма Chlorella kessleri NF на питательной среде (1) с добавлением фугата послеспиртовой барды в модельной установке по патенту 2571939, которая за одни сутки составила 8-10 г/л сухого веса, что превышает показатель прототипа в 5,5 раза.

Таким образом, предлагаемый штамм является более продуктивным по сравнению с известными и имеет широкий спектр использования биомассы: как корм для сельскохозяйственных животных; как альголизант при биологической реабилитации водоемов и при очистке сточных вод.

1. Патент РФ 1751981 от 14 декабря 1987, кл. 6 C12N 1/12. Штамм микроводоросли Chlorella vulgaris — продуцент биомассы. Богданов Н.И. 10.02.97. Бюл. №4.

2. Патент РФ 2192459 от 18.04.2001, кл. 7 c12N 1/12, C02F 3/34. Штамм микроводоросли Chlorella vulgaris BIN для получения биомассы и очистки сточных вод. Богданов Н.И. 10.11.2002. Бюл. №31.

3. Патент РФ 2527895 от 30.03.2010, кл. C2. Планктонный штамм водорослей Parachlorella nurekis и его применение для уничтожения цианобактерий. Богданов Н. 10.09.2014. Бюл. №25.

4. Патент РФ 2555519 от 12.08.2013, кл. C2. Штамм микроводоросли Chlorella vulgaris, предназначенный для очистки сточных вод сельскохозяйственных и спиртовых производств. Лобакова Е.С. и др. 10.07.2015.

5. Патент РФ 2571939 от 15.04.2015. кл. C1. Установка для непрерывного выращивания планктонных водорослей. Богданов Н.И. 27.12.2015. Бюл. №36.

6. Богданов Н.И., Эгамов М.С. Микробиологические процессы и рыбоводные результаты интенсивно эксплуатируемых прудов Таджикистана. Деп. ВИНИТИ №197 — B93, 1993. — С. 80.

Планктонный штамм Chlorella kessleri ВКПМ А1-12, предназначенный для получения биомассы.

планктонный штамм водорослей parachlorella nurekis и его применение для уничтожения цианобактерий

Группа изобретений, включающая штамм одноклеточных зеленых водорослей Parachlorella nurekis и его применение для уничтожения цианобактерий, относится к биотехнологии. Штамм Parachlorella nurekis 1904 KIEG депонирован в Коллекции Культур Водорослей и Протозоа (Culture Collection of Algae and Protozoa, CCAP), Морской институт Шотландии, Данбег, ОБАН, Аргайл, РАЗУ 1QA, Шотландия, Соединенное Королевство (Scottish Marine Institute, Dunbeg, OBAN, Argyll, PA37 1QA, Scotland, UK) под регистрационным номером CCAP № 259/1 и может быть применен для уничтожения цианобактерий. Изобретения позволяют сократить количество цианобактерий в водоемах. 2 н.п. ф-лы, 6 ил., 1 табл., 2 пр.

Рисунки к патенту РФ 2527895

Данное изобретение относится к штамму одноклеточных зеленых водорослей Parachlorella nurekis 1904 KIEG, который предназначен для продуцирования биомассы и уничтожения цианобактерий (сине-зеленых водорослей).

Предшествующий уровень техники

Существует хорошо известный штамм одноклеточных зеленых водорослей Chlorella vulgaris IFR С-111, характеризующийся высокой продуктивностью, который удовлетворяет требованиям промышленного культивирования (патент RU 1751981).

Недостаток штамма Chlorella vulgaris IFR C-111 заключается в сезонности его развития (в течение периода с мая по декабрь), требовательности к составу питательной среды, перманентном цикле развития клеток и узком диапазоне температур культивирования (26-36°С).

Недостаток штамма Chlorella vulgaris BIN заключается в отсутствии сезонного размножения в естественных резервуарах, затрудняющем его использование в различных климатических зонах. Плохое сохранение жизнеспособности в водохранилищах в температурном диапазоне от 0 до 16°С требует повторной обработки резервуара водорослями. Недостаточная способность к адаптации к естественным условиям резервуара требует дополнительной адаптации данного штамма. Другой недостаток штамма Chlorella vulgaris BIN заключается в узком диапазоне адаптации — только к определенным видам сточных вод.

Цель данного изобретения состоит в создании нового штамма одноклеточных зеленых водорослей Parachlorella nurekis 1904 KIEG, который будет отличаться более высокой продуктивностью, сезонным размножением в естественных бассейнах и жизнеспособностью в температурных интервалах от 0 до 16°С и будет обладать способностью адаптироваться к естественным условиям в различных климатических зонах и уничтожать цианобактерии, бактерии и грибы.

Одноклеточные зеленые водоросли способны исключить вышеупомянутые недостатки предыдущих штаммов. Штамм Parachlorella nurekis 1904 KIEG культивировали на основе Chlorella vulgaris BIN из коллекции Пензенского научно-исследовательского сельскохозяйственного института, Российская Академия сельскохозяйственных наук. Этот штамм культивировали в воде естественного резервуара в различных климатических зонах. В конечном итоге был выбран промежуточный штамм, который более приспособлен и менее требователен по отношению к культивированию. Его применение показало высокую гибкость в отношении водохранилищ различных климатических зон, также способность уничтожать цианобактерии, другие бактерии и грибы.

Среда: Для культивирования штамма Parachlorella nurekis 1904 KIEG авторы изобретения берут на 1 л водопроводной воды питательную среду, содержащую следующие четыре компонента.

Компонент 1: азотно-фосфорный раствор — 0.3 мл

Компонент 2: натриево-железистый раствор — 0.15 мл.

Компонент 3: медно-кобальтовый раствор — 0.2 мл

Компонент 4: раствор диоксида углерода — 10 мл

Морфологические характеристики: Новые клетки имеют слегка эллипсоидную форму и размер 2-3 мкм. Взрослые вегетативные клетки имеют 7-8 мкм в диаметре. Клетки с диаметром 8-10 мкм с уже сформировавшимися автономными спорами все еще находятся в материнской оболочке. Новые клетки имеют тонкие стенки, которые постепенно становятся толще. Когда автономные споры высвобождаются, (стенка) расщепляется на 2-3 части, которые остаются связанными. (Широкополосный (wideband) и открытый хлоропласт охватывает ¾ поверхности клетки и примыкает плотно к клеточной стенке.) Пиреноид окружен крахмальной обкладкой, состоящей из двух или трех полусфер. Размножение обеспечивается автономными спорами. Споры имеют одинаковый размер. Количество спор равно четырем, редко двум или более чем четыре. Количество спор строго четное. Деление клеток, возникновение и высвобождение автономных спор продолжается в течение целых суток без строгого выстраивания к определенному часу. Как новая, так и взрослая клетки являются темно-зелеными.

Культуральные характеристики: Клетки не аккумулируются, а распространяются равномерно в суспензионном объеме. (Сосудистые) стенки не перерастают. Водоросль культивируют и хранят в жидкой питательной среде. Она хорошо растет с использованием нитрата аммония. Водорослям необходим для питания раствор диоксида углерода, полученный из целлюлозы.

В течение культивирования клетки практически не осаждаются. В состоянии покоя клетки начинают осаждение через 5-10 дней. Процесс осаждения заканчивается через месяц.

Культивирование штамма не требует автоматического перемешивания.

Условия культивирования не (включают) сезонное размножение. (В естественных условиях сезонность иначе очень сильно выражена.) В условиях культивирования штамм требует определенной питательной среды и поддержания биотехнологического хода культивирования. На открытом воздухе водоросль адаптируется к условиям бассейна, в который она была помещена.

Штамм Parachlorella nurekis 1904 KIEG уничтожает бактерии, грибы, вызывает разрушение клеток и колонии цианобактерий вплоть до их полного уничтожения.

Цикл развития штамма нестабилен; клетки развиваются несинхронным образом.

Штамм Parachlorella nurekis 1904 KIEG возможно культивировать в 19% соленой воде.

Культивирование водорослей не требует стерильности. Штамм обладает способностью создавать условия монокультуры.

Физиологические характеристики: Штамм аутотрофный; ему необходим для питания азот, главным образом нитрат аммония. Он растет при солнечном свете, также в условиях искусственного освещения в открытых резервуарах с лампами Osram Plantastar 250 Вт. Свет проникает через слой 20 см. Штамм имеет хорошие свойства планктона, т.е. способность подниматься и равномерно распределяться в среде культивирования.

Живые клетки водорослей несут отрицательные заряды. Потеря зарядов влечет за собой коагуляцию клеток и их слипание. Способность прилипания к водородным пузырькам используется для выделения биомассы из культивационной среды путем электрической флотации.

Оптимальная температура для культивирования составляет 28-30°С. В естественных условиях водоросль растет при температуре 16-32°С, в то же время она имеет длительную жизнеспособность во всех бассейнах при температурах от 0 до 16°С.

Режим освещения соответствует продолжительности прямого иллюминационного искусственного света, обеспеченного лампами Osram Plantastar 250 Вт, освещение длится 10-12 часов. Достаточное минимальное освещение длится 8-10, максимальное освещение 12-14 часов. Развитие штамма не зависит от сезона или источника света.

Штамм ведет себя антагонистично по отношению к другим водным водорослям, бактериям, грибам или дрожжам в среде культивирования. Никакие другие водоросли не могут развиться в присутствии этого штамма. Бактерии умирают и оседают.

Жизнеспособность клеток составляет минимум 30 лет, если для культуры соблюдаются условия хранения на рассеянном свете и при комнатной температуре.

В естественных бассейнах штамм уничтожает три вида циановых бактерий (цианобактерий): Aphanizomenon, Anabaena и Microcystis. В лабораторных условиях Parachlorella nurekis 1904 KIEG вызывает разрушение клеток и колоний цианобактерий вплоть до их полного уничтожения.

Данный штамм характеризуется высокой продуктивностью (см. таблицу) и способностью противодействовать цветению воды, вызванному цианобактериями и другими бактериями и грибами.

Краткое описание графических материалов

Данное изобретение может быть лучше объяснено с помощью Фигур: на Фиг.1 показан штамм Chlorella vulgaris при увеличении 1000 х; на Фиг.2 показано подавление Cyanobacteria (Aphanizomenon flos-aquae) штаммом Parachlorella nurekis 1904 KIEG в начале эксперимента: 1 — опытные, 2 — контрольные чашки (Фиг.2-6); на Фиг.3 представлено подавление Cyanobacteria (Aphanizomenon flos-aquae) штаммом Parachlorella nurekis 1904 KIEG через три часа; на Фиг.4 представлено подавление Cyanobacteria (Aphanizomenon flos-aquae) штаммом Parachlorella nurekis 1904 KIEG через девять часов; и на Фиг.6 представлено подавление Cyanobacteria (Aphanizomenon flos-aquae) через двенадцать часов.

Смотрите так же:  Статья 339 ч 2 ук рб

Примеры осуществления данного изобретения

Пример 1. Отбирают пробы цветущего бассейна с цианобактериями Aphanizomenon flos-aquae. 100 мл пробы нужно отфильтровать и взвесить, биомассу нужно экстрагировать (300 мг) и поместить в чашку Петри, куда затем добавляют 100 мл суспензии Parachlorella (биомасса 60 мг/100 мл). 100 мл пробы с цианобактериями помещают во вторую чашку Петри. Первая чашка Петри является опытной, вторая является контрольной. Обе чашки следует хранить при рассеянном свете и при комнатной температуре.

В начале эксперимента колонии цианобактерий хорошо видны в обеих чашках. Через три часа цианобактерий в опытной чашке темнеют больше, чем в контрольной чашке. Процесс разрушения колонии начинается в опытной чашке через 6 часов. В контрольной чашке нет наблюдаемых изменений. Через 9 часов цианобактерии в опытной чашке полностью теряют свою структуру. Они выглядят как полностью бесформенный объект, темнее, чем цианобактерии в контрольной чашке. В контрольной чашке нет наблюдаемых изменений. Через 12 часов опытная чашка не содержит видимых следов циановых бактерий. Контрольная чашка не показывает изменений.

Таким образом, через 12 часов суспензия Parachlorella полностью уничтожила колонию цианобактерий с биомассой, в 5 раз превышающей биомассу Parachlorella.

Пример 2. Наливают 100 мл пробы воды из цветущего бассейна — цианобактерии Aphanizomenon flos-aquae — в две конические колбы. Биомасса цианобактерий составляет 200 мг/100 мл воды. Затем добавляют 15 мл суспензии Parachlorella nurekis 1904 KIEG в первую колбу. Биомасса Parachlorella составляет 60 мг/100 мл. Первая колба опытная, вторая контрольная. Обе колбы следует хранить при рассеянном свете и при комнатной температуре (22°С).

В начале эксперимента колонии цианобактерий можно четко наблюдать в обеих колбах. Через 6 часов можно видеть, что цианобактерии в опытной колбе темнеют больше, чем в контрольной колбе. Цианобактерии в опытной колбе полностью теряют свою структуру через 12 часов. Они выглядят бесформенными хлопьями и темнее, чем цианобактерии в контрольной колбе. В контрольной колбе нет наблюдаемых изменений. Опытная колба не содержит видимых следов циановых бактерий через 20 часов.

За 20 часов суспензия Parachlorella, помещенная в естественную среду обитания цианобактерий, полностью уничтожила колонию цианобактерий с биомассой, в 20 раз превышающей биомассу самой Parachlorella.

Цианобактерии были уничтожены в среде Parachlorella после того, как авторы изобретения обработали среду цианобактерий суспензией Parachlorella. В тоже время биомасса цианобактерий была в несколько раз больше, чем биомасса Parachlorella.

Поэтому созданный штамм водоросли Parachlorella nurekis 1904 KIEG более эффективен по сравнению с другими известными штаммами и способен полностью уничтожать цианобактерии, вызывающие цветение воды. Например, в результате использования этого штамма на Цимлянском водохранилище (Россия) авторам изобретения удалось полностью уничтожить цианобактерии за три года (2006-2009).

Штамм микроводоросли chlorella vulgaris продуцент биомассы

Номер патента: 1751981

Штамм микроводоросли Chlorella vulgaris ИФР N C-III продуцент биомассы.

Институт зоологии и паразитологии им. Е. Н. Павловского

Штамм культивируемых клеток гепатокарциномы человека, дефектный по тимидинкиназе для гибридизации и трансфекции

Номер патента: 1495375

. жидкость отсасывают, оставляя не более 50 мкл. Осадок разбива-,4 О ют поколачиванием по дну центрифужной пробирки. К осадку сразу же добавляют 0,5 мл 50 .-ного раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ) с мол. массой 1550 и осторожно ресуспендируют клет ки пипеткой. Клетки выдерживают 1 мин без перемешивания, затем раствор ПЭГ быстро разводят, добавляя 10 мл среды без сыворотки.Суспензию клеток распределяют в чашки Петри по 2 10 кл/см . Через 30 мин осторожно отсасывают культуральную жидкость и, добавляют ростовую среду, содержащую 32 сыворотки . эмбриона коровы. Клеткиинкубируют при 37 С в атмосфере 7,5% СО. Через 24 ч среду заменяют на новую, содер- жащую 10 сыворотки эмбриона коровы. Еще через 24 ч клетки снимают: расту- . 5щие в суспензии -.

Штамм культивируемых гибридных клеток животных мus мusсulus х мusтеlа vison продуцент многоканальных иммуноглобулинов класса j g норки

Номер патента: 1521772

. пред 45варительно иммунизированной суммарным 18 норки. В гибридизацию бралиВ-лимфоциты (10 ) селезенки норки.натретий день после последней инъекцииантигена (18 норки).50 Гибридизацию В-лимфоцитов норки иклеток миеломы мыши ИБО лри соотношении 10:1 соответственно проводят встандартной среде ДЕМЕ без сыворотки,с добавлением полиэтиленгликоля(М.в. 1500). После обработки в течение 3 мин полиэтиленгликолем клеткиосаждают центрифугированием при800 об/мин и суспендируют в средеДЕМЕ с добавлением 157 эмбриональнойсыворотки крупного рогатого скота,2 мМ глютамина, 19 мМ пирувате натрия, 4 10 аминоптерина, 10 гипоксантина, 16 10 М тимидина и антибиотиков. Суспензию (10 клеток в6мл среды) разливают по 0,1 мл в 96 луночные пластиковые плато и.

Штамм водоросли снlоrеllа vulgaris продуцент зеленой биомассы

Номер патента: 1530637

. не наблюдается,Ютамм поддерживе» на среде Тамияпри 20-25 С, освещенности 2000 лк,оштамм хранится при 1 ОС на агариэованной среде Тамг., которая и является минимальнои температурой роста.П р и м е р 1. Водоросли СЬ 1 оге 1 ачц 1 яагдз С-бб и СЬ 1 оге 11 а чц 11,аг 1 зЛАРГкультивируют в условиях интенсивного роста в плоскопараллельныхсосудах при круглосуточном освещениилюминесцентными лампами ЛБ(50 Вт/м ) и барботировании суспенэии35газовоэдушной смесью с 27 СО н температуре 36 С на среде Тамия н средеос мочевиной.Среда Тамия, г/л: КИОТ 5, МАМБОНО 2,5; КНРО 1,25, Ге 804 Н О0,003; ЭДТА 0,037, раствор микроэлементов 1 мл/л, г/л; НВО, ,86;гЬС 1, 1,81; 2 пБО 7 Н,О О,2; ЬО,176,4 иг/10 л, ИН.Оэ 2296,Среда с мочевиной, г/л; мочевнна1,8, аммофос.

Штамм культивируемых клеток почки эмбриона овцы для размножения вирусов

Номер патента: 1559700

Штамм культивируемых клеток почки эмбриона овцы ВСКК(Д)N Д-10 (15/2/7) для размножения вирусов.

Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus, используемый для получения моноклональных антител к интерферону человека

Номер патента: 1571063

. проводится в смесиравных объемом кондиционированной ростовой среды и 20%-ного диметилсульфоксида на ростовой среде при концентрации0,5 -1 10 клеток в 1 мл. Режим заморажи 6вания: 1 амин от 20 до минус 60 С, 10 вмин от минус 60 до 100 С, 50 в мин отминус 100 доминус 150 С. Клетки хранят вжидком азоте. Отогревают при 40 С в течение 1-2 мин; далее разбавляют 10-кратнымобъемом среды, центрифугируют 5 мин при10 1000 об/мин и высевают в ростовую среду, Жизнеспособность клеток штамма 159 Д после размораживания, определенная повключению трипанового синего, 60-70%.Контаминация, Бактерии и грибы в культуре не обнаружены, Микоплазма не выявлена по включению тимидиновой метки.П р и м е р, Каждая мышь линии ВА В/с.

Материалами базы являются авторские свидетельства и патенты на изобретения, опубликованные во времена Союза Советских Социалистических Республик.

Здесь вы найдёте описания, модели и чертежи различных устройств, механизмов, приспособлений. А также множество способов и методов получения, изготовления и производства изделий, препаратов, материалов и многого другого.

Это музей, своего рода википедия советских патентов, созданный для памяти и жителей бывшего СССР.

Изображения и тексты патентов получены из файлов базы .
Ресурс является информационным, к патентным ведомствам отношения не имеет.

Планктонный штамм chlorella vulgaris, предназначенный для получения пищевой биомассы

Владельцы патента RU 2644653:

Изобретение относится к биотехнологии. Планктонный штамм одноклеточной зеленой водоросли Chlorella vulgaris GKO, обладающий тонкой оболочкой, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ Al-24. Штамм одноклеточной зеленой водоросли Chlorella vulgaris ВКПМ Al-24 может быть использован для получения пищевой биомассы, предназначенной для приготовления напитка, концентрата, пасты или сухого порошка. Изобретение позволяет сократить срок культивирования биомассы одноклеточной водоросли. 1 пр.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой новый планктонный штамм одноклеточной зеленой водоросли Chlorella vulgaris, предназначенный для получения пищевой биомассы.

Известен типовой штамм 132-1 Chlorella vulgaris f. suboblonga. Клетки эллипсоидные, 2,8-6,1 мкм длиной и 1,7-5,5 мкм шириной, при образовании автоспор 8,0 и 5,5 мкм соответственно. Оболочка тонкая. Хлоропласт широкий поясковидный незамкнутый или корытовидный. Положение хлоропласта может быть ориентировано по отношению к длинной оси клетки продольно или поперечно. Автоспоры по 2-4, реже по 8, сразу после освобождения неправильно эллипсоидные. Типовой штамм 132-1 хранится в Ботаническом институте РАН и является музейным образцом [Андреева В.М., 1975 (стр. 41)].

Известен штамм (прототип) одноклеточной зеленой водоросли Chlorella vulgaris ИФР №С-111, предназначенный для получения биомассы и отвечающий требованиям промышленного культивирования (патент RU 1751981). Клеточная оболочка состоит из внутреннего и внешнего слоев, причем внешний слой содержит обширный миофибриллярный материал (Skaloud P. et al. 2014).

Недостатком штамма Chlorella vulgaris ИФР №С-111 является стойкий асинхронный цикл развития клеток, прочная и сравнительно толстая клеточная оболочка, а также длительный срок культивирования, который составляет четверо суток.

Цель данного изобретения состоит в создании нового планктонного штамма микроводоросли для получения пищевой биомассы, использующейся как продукт питания в виде напитка, концентрата, пасты или сухого порошка.

Техническим результатом настоящего изобретения является получение штамма микроводоросли, обладающего тонкой оболочкой и способного активно продуцировать биомассу в синхронном режиме культивирования на модифицированной питательной среде с включением в ее состав раствора углекислого газа, полученного с использованием зерноматериала (голозерного овса), сокращение срока культивирования до одних суток, за которые хлорелла проходит два жизненных цикла, что позволяет ей набрать нормативную оптическую плотность суспензии в пределах 1,8-2,0 D (440).

Смотрите так же:  Образец ходатайство о вызове в суд свидетеля

Исходным для селекции Chlorella vulgaris GKO, депонированным во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ А1-24, был штамм Chlorella vulgaris ИФР №С-111 из коллекции Института физиологии растений РАН, который культивировался на питательной среде с включением в ее состав зерноматериала (голозерного овса) для получения раствора углекислого газа. Для достижения синхронной культуры использовалась автоматическая установка (патент RU 2540011).

В результате селекции был отобран штамм, наделенный тонкой оболочкой, способный интенсивно воспроизводить биомассу в синхронном режиме культивирования и поддерживать монокультуру в процессе производства.

Морфологические признаки. Клетки эллипсоидные, особенно молодые, 2,5 мкм длиной и 1,6 мкм шириной, взрослые клетки 5,4 мкм длиной и 4,2 мкм шириной, при образовании автоспор до 7,0 мкм длиной и 5,2 мкм шириной. Оболочка клеток тонкая. Хлоропласт корытовидный, положение его по отношению к длинной оси клетки может быть продольным или поперечным. При поперечном расположении хлоропласта он имеет вид незамкнутого пояска, при этом оба конца клетки остаются свободными, может выстилать только один конец клетки. Пиреноид широкоэллипсоидный, крахмальная обертка состоит из двух полусферических скорлупок. Обычно ядро в живых клетках не видно. Автоспор по 2 и реже по 4, сразу после освобождения имеют эллипсоидную форму. Число спор только четное. Пустая оболочка материнской клетки имеет один разрыв. На агаризированной минеральной среде на седьмой день на свету образуются выпуклые гладкие блестящие колонии с ровными краями. Диаметр колоний 1-2 мм, окрашены в темно-зеленый цвет, размер клеток 4,8 мкм длиной и 4,0 мкм шириной. Цвет клеток как молодых, так и взрослых темно-зеленый.

Физиологические признаки. Штамм автотрофный, в лабораторных условиях растет на модифицированной минеральной питательной среде, в состав которой входит раствор углекислого газа, приготовленного на основе голозерного овса. Состав питательной среды (1) следующий:

1. Аммиачная селитра, ГОСТ 2-2013 — 0,18 г.

2. Аммофос, ГОСТ 18918-85, 15% раствор — 0,09 мл.

3. Калий сернокислый, ГОСТ 4145-74, 12% раствор — 0,33 мл.

4. Железо хлорид, ГОСТ 4147-74, 1% раствор — 0,15 мл.

5. Кобальт азотнокислый, ГОСТ 4528-78, 0,01% раствор — 0,5 мл.

6. Медь сернокислая, ГОСТ 4165-78, 0,01% раствор — 0,5 мл.

7. Углекислый газ, раствор (рН 3-5) — 2,0-5,0 мл.

8. Водопроводная вода по СанПиН 2.1.4.1074-01 — 1000 мл.

В производственных условиях используется рабочая питательная среда, в которую входят растворы четырех составов химических реактивов и раствора углекислого газа, приготовленного на голозерном овсе. Состав рабочей питательной среды (2) на один литр водопроводной воды по СанПиН 2.1.4.1074-01 следующий:

1. Азотно-фосфорный — 0,25 мл.

2. Железисто-натриевый — 0,15 мл.

3. Медно-кобальтовый — 0,15 мл.

4. Сернокислого калия — 0,30 мл.

5. Углекислый газ, раствор (рН 3-5) — 2,0-5,0 мл.

Штамм не требует постоянного перемешивания, подачи баллонного углекислого газа и барботирования культуры воздухом.

Использование для культивирования хлореллы раствора углекислого газа, приготовленного на голозерном овсе, способствует поддержке в суспензии СО2 в процессе роста водорослей и образованию бактериально-альгологического микробиоценоза, что в значительной мере ускоряет протекание биологических процессов в экосистеме аквакультуры (Богданов Н.И., 1986).

Освещение культуры штамма производится лампами ДНаТ- или ДРИ-250. Учитывая, что можно использовать как солнечное, так и искусственное освещение, суточный ритм состоит из двух фаз, которые относятся к световой и темновой с различными периодами освещения. Первая фаза составляет 20 часов, вторая — 4 часа, при этом световая включает два равных периода по 10 часов. После первого светового периода (этапа фотосинтеза) на 4 часа отключается освещение лампами для исполнения режима темновой фазы — этапа образования спор и выхода их из материнской клетки. Учитывая, что культура работает в синхронном режиме, ей для спорообразования и деления клеток необходимо не менее 4 часов. За период темновой фазы автоспоры освобождаются и выходят из клеток в культуру, где они готовы к дальнейшему росту. Далее светильники включаются на 10 часов для исполнения второго периода световой фазы. Таким образом, в течение суток хлорелла проходит два жизненных цикла, что позволяет ей набрать нормативную оптическую плотность клеток.

Как при солнечном, так и при искусственном освещении оптимальная температура культуры во время световой фазы 28-30°С, как снижение температуры ниже 28°С, так и повышение выше 30°С приводит к задержке роста клеток в культуре. В темновой фазе температура может снижаться до 23-25°С.

Культуральные свойства. Штамм относится к планктонным, и клетки обладают свойствами, присущими этим водорослям, т.е. они находятся во взвешенном состоянии и свободно парят в водной толще, им свойственно равномерное распределение в культуральной среде, чему способствует наличие отрицательного заряда клеток.

Штамм культивируется круглый год, сезонных изменений не отмечается, в процессе выращивания подавляет патогенную микрофлору, дрожжи, грибы и вирусы, агглютинация не происходит, автолиз клеток не наблюдается, алкалоиды отсутствуют.

Штамм выращивается в условиях монокультуры, он строго соблюдает эти условия по отношению к прочим водорослям и обладает невосприимчивостью к фагам.

Биотехнологические свойства и особенности культивирования. Для культивирования штамма используется «Установка для выращивания планктонных водорослей и светильник установки для выращивания планктонных водорослей» (патент RU 2540011), которая позволяет использовать как искусственное, так и солнечное освещение. Установка содержит систему биореакторов хлореллы, реактор раствора углекислого газа, станцию подготовки питательного раствора, светильники в виде электроламп, снабженные системой охлаждения. Устройства заполнения, регулирования, мойки и дренажа размещены и подключены под системой секций биореактров. Емкости для приготовления питательного раствора и для сбора и хранения готовой суспензии соединены с аквариумами трубопроводами. Установка позволяет обеспечить процесс производства суспензии хлореллы в автоматическом режиме. Оптимальные условия культивирования, которые создаются в установке, позволяют за одни сутки получить нормативную оптическую плотность суспензии в пределах 1,8-2,0 D (440). Культивирование штамма ведется с соблюдением требований санитарии, однако создание условий стерильности не требуется.

Клетки в культуре чувствительны к динамическим ударам и погибают при механическом перемешивании культуры в установках с электрическими насосами, а также при барботировании культуры воздухом или углекислым газом. В установке, где культивируется хлорелла, не допускается соприкосновение суспензии с металлическими предметами, трубопроводы в установке должны иметь пищевую сертификацию. Культивирование штамма выполняется при строгом соблюдении биотехнологии выращивания хлореллы.

Культивирование планктонного штамма Chlorella vulgaris GKO с использованием раствора углекислого газа, приготовленного на основе голозерного овса, способствует получению пищевой биомассы и исключает постоянное перемешивание суспензии, причем без подачи баллонного углекислого газа и барботирования ее воздухом.

Пример получения пищевой биомассы

В емкости аквариумов установки (патент RU 2540011) вводят рабочую питательную среду (2) и маточную культуру планктонного штамма Chlorella vulgaris GKO с оптической плотностью 1,8-2,0 D (440) в соотношении 1:1. Включают освещение на 10 часов. В процессе культивирования температуру суспензии в аквариумах поддерживают на уровне 28-30°С. По истечении этого периода лампы отключают на 4 часа. По окончании 4 часов повторно включают лампы на 10 часов.

По окончании второго светового периода культуру сливают и используют как пищевую биомассу для приготовления напитка, концентрата, пасты или сухого порошка. За суточный период культивирования биомасса составляет 1,0 г/л сухого веса.

Следующие материалы иллюстрируют достижение цели. Получена пищевая биомасса в автоматической установке (патент RU 2540011) с использованием планктонного штамма Chlorella vulgaris GKO в процессе синхронного культивирования на рабочей питательной среде (2), которая за одни сутки достигла нормативного показателя по оптической плотности 1,8-2,0 D (440).

Штамм микроводоросли Chlorella vulgaris GKO успешно прошел этап лабораторного, экспериментального, полупромышленного, промышленного культивирования и используется для приготовления пищевых продуктов.

Таким образом, получен новый планктонный штамм микроводоросли Chlorella vulgaris GKO, обладающий тонкой оболочкой, способный активно продуцировать биомассу в синхронном режиме культивирования на модифицированной питательной среде с включением в ее состав раствора углекислого газа, приготовленного с использованием зерноматериала (голозерного овса), и предназначенный для получения пищевой биомассы, которая может быть использована для приготовления напитка, концентрата, пасты или сухого порошка.

1. Андреева В.М. Род Chlorella. Морфология, систематика, принципы классификации. Л.: «Наука», Ленингр. отд., 1975. — 110 с.

2. Патент РФ 1751981 от 14 декабря 1987, кл. 6 C12N 1/12. Штамм микроводоросли Chlorella vulgaris — продуцент биомассы. Богданов Н.И. 10.02.97. Бюл. №4.

3. Skaloud P., Nemcova Y., Pytela J., Bogdanov N.I., Bock С, Pickinpaugn S.H. Planktochlorella nurekis gen. et. sp. nov. (Trebouxiophyceae, Chlorophyta), a novel coccoid green alga carrying significant biotechnological potential. Fottea, Olomouc, 14 (1): 53-62, 2014.

4. Патент РФ 2540011 от 10 декабря 2013, кл. С12М 1/00. Установка для выращивания планктонных водорослей и светильник установки для выращивания планктонных водорослей. Грабарник В.Е., Карелин Н.В. 27.01.2015.

5. Богданов Н. И. Культивирование хлореллы и ее продуктивность в Таджикистане. Доклады АН Таджикской ССР. Том XXIX, №6. Душанбе, 1986. — С. 370-372.

Планктонный штамм Chlorella vulgaris ВКПМ Al-24, предназначенный для получения пищевой биомассы.

Патент рф 1751981